Страница 2

G-белки - это регуляторные белки, связывающие при активации ГТФ. Лучше всего изучены G-белки, стимулирующие и ингибирующие аденилатциклазу (Gs - белки и Gi-белки соответственно). βı - адренорецепторы, β2 - адренорецепторы и D1 рецепторы сопряжены с белком Gs, и поэтому стимуляция этих рецепторов сопровождается активацией аденилатциклазы и повышением внутриклеточной концентрации цАМФ - классического второго (внутриклеточного) посредника. Конечный ответ в разных клетках различен и зависит от того, что представляет собой эффекторные фрагменты (фермент, ионный канал и пр) α2– адренорецепторы, М2-холинорецепторы и D2-рецепторы сопряжены с белком Gi, и стимуляция этих рецепторов приводит к снижению активности аденилатциклазы и внутриклеточной концентрации цАМФ. Изменения активности ферментов и других внутриклеточных белков и, соответственно, клеточных функций при этом противоположны тем, что наблюдаются при активации белка Gs. α1-адренорецепторы (как и М1-холинорецепторы), видимо, сопряжены с другим, пока еще мало изученным типом G-белка. Этот белок иногда обозначают Gq. Он активирует фосфолипазу С, катализирующую распад мембранных фосфолипидов, в частности - фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата до ИЗФ и ДГА. Оба эти вещества являются вторичными посредниками.

Связывание агониста (гормона, нейромедиатора и др.) с соответствующим рецептором приводит к белок-белковому взаимодействию между рецептором и G-белком и ускоряет диссоциацию ГДФ. В результате образуется короткоживущий комплекс агонист - рецептор - G-белок, не связанный ни с каким нуклеотидом. Связывание с этим комплексом молекулы ГТФ снижает сродство рецептора к G-белку, что приводит к диссоциации комплекса и высвобождению рецептора. Потенциально рецептор может активировать большое количество молекул G-белка, обеспечивая, таким образом, высокий коэффициент усиления внеклеточного сигнала на данном этапе. Активированная α-субъединица G-белка диссоциирует от βγ-субъединиц и вступает во взаимодействие с соответствующим эффектором, оказывая на него активирующее или ингибирующее воздействие.

α-субъeдиница с присоединенным с ней ГТФ способна взаимодействовать с эффектором в мембране - ферментами, такими, как аденилатциклаза, или, возможно, ионными каналами. Фермент может активироваться или ингибироваться, а ионный канал - открываться или закрываться. Конкретные примеры будут рассмотрены в последующих разделах. Взаимодействие с эффектором, однако, длится до тех пор, пока α - субъединица, являющаяся ГТФазой, удерживает ГТФ. Так что, очень вскоре присоединенный ГТФ гидролизуется до ГДФ. Когда это происходит, α - субъединица снова меняет свою конформацию и теряет способность активировать эффектор. После этого α-ГДФ взаимодействует с βγ-комплексом и снова образует тримерный комплекс, завершая, таким образом, цикл. Предполагают также, что комплекс из βγ-субъединиц тоже может (прямо или опосредованно) влиять на эффекторные ферменты.

Такими ферментами являются аденилатциклаза, фосфолипаза С. G-белки также регулируют работу К и Са²+-ионных каналов, К G-белкам относятся полипептид Gs, стимулирующий аденилатциклазу и регулирующий Са²+-ионные каналы, полипептид Gi, ингибирующий аденилатциклазу, и регулирующий К+-каналы в клетках тканей мозга, Gt, трансдуцин, участвующий в передаче светового сигнала, Golf специфичный белок обонятельных ресничек и др. Все G-белки являются гетеротримерами, состоящими из субъединиц α, β‚ и γ в порядке уменьшения молекулярной массы.

Впоследствии ГТФ, связанный с α-субъединицей G-белка, подвергается гидролизу, причем ферментом, катализирующим этот процесс, является сама α-субъединиц. Это приводит к диссоциации α-субъединицы от эффектора и реассоциации комплекса α-ГДФ с βγ - субъединицами. Спонтанная активация G-белка, связанного с ГДФ - весьма маловероятный процесс.

Также смотрите:

Белая куропатка – Lagopus lagopus
Имеет большое промысловое значение. Самцы больше самок. Средний вес 580-600 г. Оседлая птица. В лесной зоне белая куропатка держится главным образом на моховых болотах. На зиму переселяется в речные долины, на берега озер, где растут ивы и березки, почками и побегами...

Суточная потребность в биотине.
Суточная потребность в витамине Н разных животных различна, но для человека она равна 9 мкг. Богаты витаминами Н печень, почки и молоко, очень много биотина в желтке яиц. В свежем коровьем молоке, содержится биотина меньше, чем в постоявшем. В 1 л только что надоен...

Экологическое разнообразие современного человека
Морфологические и физиологические особенности человека, т. е. его конституция и функциональная активность давно представляют всеобщий интерес, который восходит к далекому прошлому. Еще великий врач древности Гиппократ различал сильную, плотную, влажную и жировую конст...

Большинство рецепторов относятся к семейству семикратно пересекающих мембрану серпентиновых (змееподобных) рецепторов. Эти рецепторы выполняют разнообразные биологические сигнальные функции. К ним относятся рецепторы вкусовых клеток. Сотни различных разновидностей рецепторов, находящихся на клетках обонятельных луковиц нашего носа передают информацию относительно присутствия лигандов-ароматов. Серпентиновые рецепторы имеют очень древнее происхождение. Их используют, например, клетки дрожжей, которые выделяют необходимые для спаривания полипептидные факторы и распознают их с помощью поверхностных рецепторов, представляющих собой все те же семикратно пересекающие мембрану серпентиновые рецепторы. Уникальная структура лиганд-связывающих участков серпентиновых рецепторов позволяет связывать лиганды различной природы и молекулярной массы.

Существуют сотни различных форм G-белковых рецепторов, а химическое разнообразие их лигандов чрезвычайно велико. Высокоспецифичные рецепторы этого семейства реагируют на :

ü небольшие молекулы, такие как катехоламины, пептиды и хемокины;

ü высокомолекулярные соединения, такие как гликопротеиновые гормоны;

ü тромбин;

ü световые импульсы;

ü летучие пахучие вещества.

Хотя общее строение G-белков одинаково, выявлены важные различия :

Ø различное расположение этих белков в липидном бислое;

Ø различия пространственной структуры рецепторов, что объясняет наличие различных
участков связывания и специфичность этих молекул.

Рисунок 8 иллюстрирует некоторые структурные различия рецепторов, сцепленных с G-белком, и объясняет широкую лигандную специфичность белков этого класса.

К началу 90-х годов было выделено более ста таких рецепторов, сопряженных с G-белком. К этому суперсемейству относятся рецепторы катехоламинов, ацетилхолина, серотонина, гистамина, ангиотензинов и др.

Они образуют суперсемейство интегральных белков длиной 400-600 аминокислот. В составе цепочки имеются 7 высококонсервативных участков , образованных 22-28 гидрофобными аминокислотами (рис.9 и рис. 10). Данные гидрофобные участки образуют, вероятно, альфа-спирали и 7 раз прошивают плазматическую мембрану. Они разделены крупными гидрофильными сегментами, обращенными наружу и внутрь клетки. N-конец молекулы рецептора расположен во внеклеточном пространстве и имеет участки, по которым происходит N-гликозилирование. Предполагается, что сахарные участки участвуют в прикреплении N-конца рецептора к мембране. На C-концевом фрагменте, обращенном внутрь клетки , имеются участки, по которым может происходить фосфорилирование цАМФ-зависимой ГТФазы . Участок взаимодействия с ГТФ-связывающим белком находится в третьей цитоплазматической петле.

Отличительными структурными чертами серпентиновых рецепторов вообще является наличие внеклеточного N-конца и внутриклеточного С-конца , семи трансмембранных спиралей (ТМ), трех внеклеточных (е1-3) и трех внутриклеточных петель (i1-3) (см. рис. 10).

G-белки – это семейство белков, относящихся к GTPазам и функционирующих в качестве вторичных посредников во внутриклеточных сигнальных каскадах. G-белки названы так, поскольку в своём сигнальном механизме они используют замену GDP на GTP как молекулярный функциональный «выключатель» для регулировки клеточных процессов.

G-белки делятся на две основных группы:

Ø «большие» гетеротримерные – это белки с четвертичной структурой , состоящие из трех субъединиц:

ü альфа(α),

ü бета (β),

ü гамма (γ)

Ø «малые» – это белки из одной полипептидной цепи , они имеют молекулярную массу 20-25 кДа и относятся к суперсемейству Ras (малые G-белки, регулируют деление клеток) малых GTPаз. Их единственная полипептидная цепь гомологична α-субъединице гетеротримерных G-белков.

Обе группы G-белков участвуют во внутриклеточной сигнализации.

Основной механизм сигнального действия G-белков. G-белок состоит из трех полипептидов:

ü α-субъединица, соединена с молекулой GTP и гидролизует ее,

ü β- и γ-субъединицы образуют димер, плотно соединенный нековалентными связями.

При соединении α-субъединицы с молекулой GDP и с βγ-субъединицами образуется неактивный тример , который прикрепляется к С-концевому участку рецептора. Связывание лиганда с этим рецептором приводит к изменению конформации цитоплазматического домена рецептора. Конформация α-субъединицы также изменяется, при этом ее сродство к GDP снижается, и GDP отщепляется от активного участка α-субъединицы .

GTP быстро связывается с активным участком, поскольку его внутриклеточная концентрация приблизительно в 10 раз превышает концентрацию GDP. После связывания GTP α-субъединица принимает активную конформацию и отщепляется как от рецептора, так и от βγ-субъединицы. GTP-связанная α-субъединица активирует различные эффекторные молекулы (например, аденилатциклазу, образующую сАМР). α-субъединица остается в активном состоянии до тех пор, пока входящая в ее состав GTPaзa не гидролизует GTP до GDP . Сразу после гидролиза GTP α- и βγ-субъединицы вновь соединяются и возвращаются к рецептору. Основные этапы этого процесса представлены на рис. 11.

Раньше считалось, что только α-субъединица G-белка взаимодействует с эффектором, а βγ-комплекс либо совсем не участвует в этом процессе, либо действует как отрицательный регулятор. Сейчас известно, что βγ-субъединица также может активировать эффекторные молекулы (например, мускариновые К + -каналы). Таким образом, и α-субъединица, и βγ-комплекс участвуют в регуляции клеточного ответа.

Эффекторные молекулы, взаимодействующие с G-белками. G-белки играют ключевую роль в активации каскада эффекторных молекул. К основным эффекторным молекулам, контролируемым G-белками, относятся:

ü аденилатциклаза

ü фосфолипаза С (PLC)

ü фосфолипаза А 2 (PLA2)

ü фосфоинозитид-3-киназа (РI 3 -киназа)

ü киназа β-адренорецептора (PARK)

Хотя в регуляции участвуют и α-субъединица, и βγ-комплекс, механизм регуляции специфичен для каждого эффектора. Например, существуют несколько различных форм аденилатциклазы. Каждая форма этой эффекторной молекулы активируется различными субъединицами G-белка: либо α, либо βγ, либо обеими субъединицами.

Физиологическая роль рецепторов, сопряженных с G-белками. Рецепторы, связанные с G-белками вовлечены в широкий круг физиологических процессов. Вот некоторые примеры:

1. зрение: опсины используют реакцию фотоизомеризации для превращения электромагнитного излучения в клеточные сигналы. Родопсин, например, использует превращение 11-цис-ретиналя в полностью-транс-ретиналь для этой цели

2. обоняние: рецепторы обонятельного эпителия связывают пахучие вещества (обонятельные рецепторы) и феромоны (вомероназальные рецепторы)

3. регуляция поведения и настроения: рецепторы в мозге млекопитающих связывают несколько различных нейромедиаторов, включая серотонин, дофамин, гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК) и глутамат

4. регуляция активности иммунной системы и воспаления: хемокиновые рецепторы связывают лиганды, которые осуществляют межклеточную коммуникацию в иммунной системе; рецепторы, такие как гистаминовый рецептор, связывают медиаторы воспаления и вовлекают определенные типы клеток в воспалительный процесс

5. функционирование вегетативной нервной системы: как симпатическая, так и парасимпатическая нервная система регулируются посредством рецепторов, связанных с G-белками, ответственных за многие автоматические функции организма, такие как поддержание кровяного давления, частоты сердечных сокращений и пищеварительных процессов

Усиление в каскадах передачи сигналов. В течение краткого периода своей активности аденилатциклаза производит несколько сотен молекул цАМФ (рис. 12). После того, как произведенные молекулы цАМФ активируют протеинкиназу А, она фосфорилирует и активирует фермент гликогенфосфорилазу, которая расщепляет гликоген до глюкозо-1-фосфата. Протеинкиназа А фосфорилирует также гликогенсинтазу, что приводит к ингибированию ее активности и, таким образом, предотвращает преобразование освобожденной глюкозы в гликоген. Эти два эффекта вместе обеспечивают мобилизацию глюкозы через расщепление гликогена, запасенного в печени.

В этом каскаде происходит огромное усиление сигнала. Одна молекула адреналина может вызвать активацию сотен α субъединиц G белков. Каждая из них в свою очередь будет активировать аденилатциклазу, которая в свою очередь синтезирует сотни молекул цАМФ. цАМФ активирует протеинкиназу А, которая модифицирует сотни молекул-мишений в клетке.

Сигнальные G-белки являются универсальными посредниками при передаче гормональных сигналов от рецепторов клеточной мембраны к эффекторным белкам , вызывающим конечный клеточный ответ.

Они являются объектом интенсивного изучения в связи с их участием во многих важных физиологических процессах (см. обзоры Gilman, 1987 ; Neer, Clapham, 1988 ; Freissmuth et al.,1989 , Кухарь В.П. ea, 1992). G-белки, участвующие в передаче сигнала, являются членами большого надсемейства гуанин-связывающих белков. G- белки - это прецизионные регуляторы, включающие или выключающие активность других молекул.

Связывание агониста (гормона, нейромедиатора и др.) с соответствующим рецептором приводит к белок-белковому взаимодействию между рецептором и G-белком и ускоряет диссоциацию ГДФ. В результате образуется короткоживущий комплекс агонист - рецептор - G-белок, не связанный ни с каким нуклеотидом. Связывание с этим комплексом молекулы ГТФ снижает сродство рецептора к G-белку, что приводит к диссоциации комплекса и высвобождению рецептора. Потенциально рецептор может активировать большое количество молекул G-белка, обеспечивая, таким образом, высокий коэффициент усиления внеклеточного сигнала на данном этапе. Активированная альфа-субъединица G-белка (альфа* ГТФ Мg). [ Bourne, ea 1997 ] диссоциирует от бета-гамма-субъединиц и вступает во взаимодействие с соответствующим эффектором, оказывая на него активирующее или ингибирующее воздействие.

Альфа-субъдиница с присоединенным с ней ГТФ способна взаимодействовать с эффектором в мембране - ферментами, такими, как аденилатциклаза , или, возможно, ионными каналами . Фермент может активироваться или ингибироваться, а ионный канал - открываться или закрываться. Конкретные примеры будут рассмотрены в последующих главах. Взаимодействие с эффектором, однако, длится до тех пор, пока альфа- субъединица, являющаяся ГТФ-азой, удерживает ГТФ. Так что, очень вскоре присоединенный ГТФ гидролизуется до ГДФ. Когда это происходит, альфа- субъединица снова меняет свою коонформацию и теряет способность активировать эффектор. После этого альфа-ГДФ взаимодействует с бета- гамма-комплексом и снова образует тримерный комплекс, завершая, таким образом, цикл ( рис. 1.9). Предполагают также, что комплекс из бета-гамма-субъединиц тоже может (прямо или опосредованно) влиять на эффекторные фермент ы.

Впоследствии ГТФ, связанный с альфа-субъединицей G-белка, подвергается гидролизу, причем ферментом, катализирующим этот процесс, является сама альфа-субъединица . Это приводит к диссоциации альфа-субъединицы от эффектора и реассоциации комплекса альфаГДФ с бета-гамма-субъединицами. Спонтанная активация G-белка, связанного с ГДФ - весьма маловероятный процесс.

Этот же механизм лежит в основе гормональной регуляции фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С ( Boyer et al., 1989) и фосфолипазы А 2 ( Axelrod et al., 1988). Кроме того, было показано, что G белки могут непосредственно активировать ионные каналы ( Sternweis, Pang, 1990). см. также:

Лимитирующей стадией процесса восстановления исходного состояния G-белка является скорость диссоциации GDP от альфа-субъединицы G-белка. Скорость диссоциации увеличивается при взаимодействии G-белок-GDP с агонист-связанным рецептором [ Branot D.R.,1986 ]. Связывание GTP G-белком приводит, очевидно, к образованию комплекса агонист-рецептор-G-белок. Аналог GTP-CTP-гамма-S и Mg 2+ усиливает диссоциацию альфа-субъединицы из тримера G-белка [ Northup J.V.,1983 ]. Однако следует заметить, что каталитическая субъединица аденилатциклазы из мембран мозга быка хроматографически соочищается с альфа- и бета-субъединицами G S -белка [ Marbach J.,1990 ] и вопрос диссоциации альфа-субъединиц из тримера G-белка для активации эффектора требует уточнения.

G-белки проявляют значительный полиморфизм. Каждая из форм субъединиц G-белка высокогомологична по структуре, близка по функциям, но отличается молекулярной массой и электрофоретической подвижностью [ Перцева М.Н.,1990 ]. Особенно широк полиморфизм и наиболее изучен для альфа s и альфа i G-белков. Так из мозга человека выделено 11 форм сДНК, ответственных за синтез альфа s субъединиц, четыре вида которых клонированы и, предполагается, что они определяют синтез четырех изоформ альфа s в мозге человека [ Bray P.,1986 ]. Для альфа i найдены, в основном, три изоформы альфа i 1, альфа i 2, альфаi 3 . Молекулярные массы изоформы альфаs находятся в пределах 42-55 кДа, а альфаi -39-41 кДа [ Перцева М.Н.,1990 ]. Распределение молекулярных вариантов альфаi носит тканеспецифический характер: альфа i 1 представлена, в основном, в мозге, альфа i 2 обнаружена в нервной ткани и в клетках крови, альфаi 3 представлена в переферических тканях и отсутствует в мозге [ ; Itoh I.,1988 ]. Что касается изоформ альфа-субъединиц G s -белков, то пока неясно, кодируются ли изоформы разными структурными генами или это продукт одного гена с последующим внутренним альтернативным сплайсингом исходного РНК-транскрипта [ Robishaw J.D.,1986 ], или множественность их результат посттрансляционной модификации [ Casey P.J.,1988 ]. В настоящее время известно 9 структурных генов, кодирующих C-белки и 12 продуктов этих генов [

ТРАНСМЕМБРАННАЯ ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА. Важное свойство мембран - способность воспринимать и передавать внутрь клетки сигналы из внешней среды. "Узнавание" сигнальных молекул осуществляется с помощью белков-рецепторов, встроенных в клеточную мембрану клеток-мишеней или находящихся в клетке.

Если сигнал воспринимается мембранными рецепторами, то схему передачи информации можно представить так:

взаимодействие рецептора с сигнальной молекулой (первичным посредником);

активация мембранного фермента, ответственного за образование вторичного посредника;

образование вторичного посредника цАМФ, цГМФ, ИФ3, ДАТ или Са 2+ ;

активация посредниками специфических белков, в основном протеинкиназ, которые, в свою очередь, фосфорилируя ферменты, оказывают влияние на активность внутриклеточных процессов.

Существует несколько механизмов трансмембранной передачи информации: с использованием аденилатциклазной системы, инозитолфосфатной системы, каталитических рецепторов, цитоплазматических или ядерных рецепторов.

Cтруктурно-функциональная организация G-белков

G-белки (ГТФ-связывающие белки) - универсальные посредники при передаче сигналов от рецепторов к ферментам клеточной мембраны, катализирующим образование вторичных посредников гормонального сигнала. G-белки - олигомеры, состоящие из α, β и γ-субъединиц.

Каждая α-субъединица в составе G-белка имеет специфические центры:

связывания ГТФ или ГДФ;

взаимодействия с рецептором;

связывания с βγ-субъединицами;

фосфорилирования под действием протеинкиназы С;

взаимодействия с ферментом аденилатциклазой или фосфолипазой С.

В структуре G-белков отсутствуют α-спиральные, пронизывающие мембрану домены. G-белки относят к группе "заякоренных" белков.

Регуляция активности G-белков

Различают неактивную форму G-белка - комплекс αβγ-ГДФ и активированную форму αβγ-ГТФ. Активация G-белка происходит при взаимодействии с комплексом активатор-рецептор, изменение конформации G-белка снижает сродство α-субъединицы к молекуле ГДФ и увеличивает к ГТФ. Замена ГДФ на ГТФ в активном центре G-белка нарушает комплементарность между α-ГТФ и βγ-субъединицами. Рецептор, связанный с сигнальной молекулой, может активировать большое количество молекул G-белка, таким образом обеспечивая усиление внеклеточного сигнала на этом этапе.

Активированная α-субъединица G-белка (α-ГТФ) взаимодействует со специфическим белком клеточной мембраны и изменяет его активность. Такими белками могут быть ферменты аденилатциклаза, фосфолипаза С, фосфоди-эстераза цГМФ, Nа+-каналы, К+-каналы.

Рис. 5-35. Цикл функционирования G-белка. R s - рецептор; Г - гормон; АЦ - аденилатциклаза.

Следующий этап цикла функционирования G-белка - дефосфорилирование ГТФ, связанного с α-субъединицей, причём фермент, катализирующий эту реакцию, - сама α-субъединица.

Дефосфорилирование приводит к образованию комплекса α-ГДФ, который не комплементарен специфическому белку мембраны (например, аденилатциклазе), но имеет высокое сродство к ру-протомерам. G-белок возвращается к неактивной форме - αβγ-ГДФ. При последующей активации рецептора и замене молекулы ГДФ на ГТФ цикл повторяется снова. Таким образом, α-субъединицы G-белков совершают челночное движение, перенося стимулирующий или ингибирующий сигнал от рецептора, который активирован первичным посредником (например, гормоном), на фермент, катализирующий образование вторичного посредника.

Некоторые формы протеинкиназ могут фосфорилировать α-субъединицы G-белков. Фосфорилированная α-субъединица не комплементарна специфическому белку мембраны, например аденилатциклазе или фосфолипазе С, поэтому не может участвовать в передаче сигнала.

Аденилатциклаза

Фермент аденилатциклаза, катализирующий превращение АТФ в цАМФ, - ключевой фермент аденилатциклазной системы передачи сигнала. Фермент относят к группе интегральных белков клеточной мембраны, он имеет 12 трансмембранных доменов. Внеклеточные фрагменты аденилатциклазы гликозилированы. Цитоплазматические домены аденилатциклазы имеют два каталитических центра, ответственных за образование цАМФ - вторичного посредника, участвующего в регуляции активности фермента протеинкиназы А.

На активность аденилатциклазы оказывают влияние как внеклеточные, так и внутриклеточные регуляторы. Внеклеточные регуляторы (гормоны, эйкозаноиды, биогенные амины) осуществляют регуляцию через специфические рецепторы, которые с помощью α-субъединиц G-белков передают сигналы на аденилатциклазу. α s -Субъединица (стимулирующая) при взаимодействии с аденилатциклазой активирует фермент, α-субъединица (ингибирующая) ингибирует фермент. Из 8 изученных изоформ аденилатциклазы 4 - Са 2+ -зависимые (активируются Са 2+). Регуляция аденилатциклазы внутриклеточным кальцием позволяет клетке интегрировать активность двух основных вторичных посредников цАМФ и Са 2+ .

Аденилатциклазная система

При участии аденилатциклазной системы реализуются эффекты сотни различных по своей природе сигнальных молекул - гормонов, нейромедиаторов, эйкозаноидов.

Функционирование системы трансмембранной передачи сигналов обеспечивают белки: Rs-рецептор сигнальной молекулы, которая активирует аденилатциклазу, и R i -рецептор сигнальной молекулы, которая ингибирует аденилатциклазу; G s -стимулирующий и G j -ингибирующий аденилатциклазу белки; ферменты аденилатциклаза (АЦ) и протеинкиназа А (ПКА).

Последовательность событий, приводящих к активации аденилатциклазы:

связывание активатора аденилатциклазной системы, например гормона (Г) с рецептором (R s), приводит к изменению конфор-мации рецептора и увеличению его сродства к G s -белку. В результате образуется комплекс [Г][R][О-ГДФ];

присоединение [Г][R] к G-ГДФ снижает сродство α-субъединицы G s -белка к ГДФ и увеличивает сродство к ГТФ. ГДФ замещается на ГТФ;

это вызывает диссоциацию комплекса. Отделившаяся субъединица α, связанная с молекулой ГТФ, обладает сродством к адени-латциклазе:

[Г][R] → [Г][R] + α-ГТФ + βγ;

взаимодействие α-субъединицы с аденилатциклазой приводит к изменению конфор-мации

фермента и его активации, увеличивается скорость образования цАМФ из АТФ;

конформационные изменения в комплексе [α-ГТФ][АЦ] стимулируют повышение ГТФ-фосфатазной активности α-субъединицы. Протекает реакция дефосфорилирования ГТФ, и один из продуктов реакции - неорганический фосфат (P i) отделяется от α-субъединицы, а комплекс [α-ГДФ] сохраняется; скорость гидролиза определяет время проведения сигнала;

образование в активном центре α-субъединицы молекулы ГДФ снижает его сродство к аденилатциклазе, но увеличивает сродство к βγ-субъединицам. G s -белок возвращается к неактивной форме;

если рецептор связан с активатором, например гормоном, цикл функционирования G s белка повторяется.

Аденилатциклазная система

G-белки (ГТФ-связывающие белки) - универсальные посредники при передаче сигналов от рецепторов к ферментам клеточной мембра­ны, катализирующим образование вторичных посредников гормонального сигнала. G-белки - олигомеры, состоящие из α, β и γ-субъединиц. Состав димеров βγ незначительно раз­личаются в разных тканях, но в пределах одной клетки все G-белки, как правило, имеют оди­наковый комплект βγ-субъединиц. Поэтому G-белки принято различать по их α-субъединицам.. Выявлено 16 генов, кодирующих различные α-субъединицы G-белков. Некоторые из генов имеют более одного белка, вследствие альтер­нативного сплайсинга РНК.

Каждая α-субъединица в составе G -белка имеет специфические центры:

Связывания ГТФ или ГДФ;

Взаимодействия с рецептором;

Связывания с βγ-субъединицами;

Фосфорилирования под действием протеин­киназы С;

Взаимодействия с ферментом аденилатциклазой или фосфолипазой С.

В структуре G -белков отсутствуют α-спиральные, пронизывающие мембрану домены. G -бел­ки относят к группе «заякоренных» белков (рис. 5-34).

Рис. 5-34. Положение G-белков в мембране. Для ассоциации G-белков важно ацилирование α-протомеров алифатическими радикалами жирных кислот, миристиновой кислоты (М) или изопреновой. γ-Субъединица G-белка имеет геранил-геранильную группу (Г), связанную тиоэфирной связью с остатком цистеина С-конца.

Регуляция активности G -белков

Различают неактивную форму G -белка - комплекс αβγ-ГДФ и активированную форму αβγ -ГТФ. Активация G-белка происходит при взаимодействии с комплексом активатор-рецеп­тор, изменение конформации G-белка снижает сродство α-субъединицы к молекуле ГДФ и уве­личивает к ГТФ. Замена ГДФ на ГТФ в актив­ном центре G-белка нарушает комплементарность между α-ГТФ и βγ-субъединицами. Рецептор, связанный с сигнальной молекулой, может активировать большое количество моле­кул G-белка, таким образом обеспечивая уси­ление внеклеточного сигнала на этом этапе (рис. 5-35).

Рис. 5-35. Цикл функционирования G-белка. R s - рецептор; Г - гормон; АЦ - аденилатциклаза.

Активированная α-субъединица G-белка (α-ГТФ) взаимодействует со специфическим белком клеточной мембраны и изменяет его ак­тивность. Такими белками могут быть фермен­ты аденилатциклаза, фосфолипаза С, фосфодиэстераза цГМФ, Na + -каналы, К + -каналы.

Следующий этап цикла функционирования G-белка - дефосфорилирование ГТФ, связанного с α-субъединицей, причём фермент, катализи­рующий эту реакцию, - сама α-субъединица.

Дефосфорилирование приводит к образованию комплекса α-ГДФ, который не комплементарен специфическому белку мембраны (например, аденилатциклазе), но имеет высокое сродство к βγ-протомерам. G-белок возвращается к неак­тивной форме - αβγ-ГДФ. При последующей активации рецептора и замене молекулы ГДФ на ГТФ цикл повторяется снова. Таким обра­зом, α-субъединицы G-белков совершают чел­ночное движение, перенося стимулирующий или ингибирующий сигнал от рецептора, который ак­тивирован первичным посредником (например, гормоном), на фермент, катализирующий обра­зование вторичного посредника.

Некоторые формы протеинкиназ могут фосфорилировать α-субъединицы G-белков. Фосфорилированная α-субъединица не комплементарна специфическому белку мембраны, например, аденилатциклазе или фосфолипазе С, поэтому не может участвовать в передаче сигнала.

Г. аденилатциклаза

Фермент аденилатциклаза, катализирующий превращение АТФ в цАМФ (рис. 5-36), - клю­чевой фермент аденилатциклазной системы пе­редачи сигнала. Аденилатциклаза обнаружена во всех типах клеток.

Рис. 5-36. Образование циклического аденозинмонофосфата (цАМФ).

Фермент относят к группе интегральных бел­ков клеточной мембраны, он имеет 12 транс­мембранных доменов. Внеклеточные фраг­менты аденилатциклазы гликозилированы. Цитоплазматические домены аденилатциклазы имеют два каталитических центра, ответственных за образование цАМФ - вторичного по средника, участвующего в регуляции активности фермента протеинкиназы А.

На активность аденилатциклазы оказывают влияние как внеклеточные, так и внутриклеточные регуляторы. Внеклеточные регулятор (гормоны, эйкозаноиды, биогенные амины) осуществляют регуляцию через специфические рецепторы, которые с помощью α-субъединиц G-белков передают сигналы на аденилатциклазу. αs - Субъединица (стимулирующая) при взаимодействии с аденилатциклазой активирует фермент, αi- Субъединица (ингибирующая) ингибирует фермент. В свою очередь, аденилатциклаза стимурирует проявление ГТФ- фосфотазной активности α- субъединиц. В результате дефосфорилирования ГТФ образуются субъединицы а s -ГДФ и а i -ГДФ, не комплементарные аденилатциклазе.

Из 8 изученных изоформ аденилатциклазы 4 - Са 2+ -зависимые (активируются Са 2+). Ре­гуляция аденилатциклазы внутриклеточным кальцием позволяет клетке интегрировать ак­тивность двух основных вторичных посредни­ков цАМФ и Са 2+ .

Д. фосфолипазы

Фосфолипазы - ферменты класса гидролаз, катализирующие катаболизм глицерофосфолипидов. Различают фосфолипазы секреторные, входящие в состав панкреатического сока, и клеточные фосфолипазы. Клеточные фосфоли­пазы А 1 , А 2 , D, С различаются по специфично­сти к отщепляемой группе. Все фосфолипазы - кальций зависимые ферменты (рис. 5-37).

Рис. 5-37. Действие фосфолипаз.

Фосфолипаза С - фермент, гидролизующий фосфоэфирную связь в глицерофосфолипидах. В клетках человека идентифицировано 10 изоформ фосфолипазы С, различающихся по молекулярной массе, локализации, способу регуляции, субстратной специфичности. В структуре всех изоформ фосфолипазы С отсутствуют гидрофобные домены, которые могли бы обеспечить их взаимодействие с мембраной. Однако некоторые формы фосфолипазы С связаны с помощью гидрофобного «якоря» - ацильного остатка миристиновой кислоты или за счёт взаимодействия с поверхностью бислоя. Каталитическая активность всех изоформ фосфолипазы С зависит от ионов кальция.

Большинство фосфолипаз С специфично в отношении фосфатидилинозитолов и практически не гидролизует другие типы фосфолипидов. Активный фермент может гидролизовать до 50% от общего количества фосфатидилино­зитолов клеточной мембраны. При гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (ФИФ 2) образуются продукты диацилглицерол (ДАГ) и инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ 3), служащие вторичными посредниками в трансмембранной передаче сигнала по инозитолфосфатному пути.

Е. протеинкиназы

Все полярные сигнальные молекулы, действу­ющие на клетку-мишень через мембранные ре­цепторы, осуществляют свою биологическую фун­кцию путём фосфорилирования специфических белков и ферментов, регулирующих метаболизм в клетке. Фосфорилирование изменяет (увеличи­вает или уменьшает) их активность. Катализиру­ют фосфорилирование белков (протеинов) протеинкиназы по аминокислотным остаткам серина, треонина, тирозина. Протеинкиназы могут быть субъединицей мембранного рецептора, например тирозиновая протеинкиназа рецептора инсулина, активность которой регулируется гормоном. Дру­гая группа - протеинкиназы, регулируемые вто­ричными вестниками гормонального сигнала (цАМФ, цГМФ, Са 2+ , ДАГ), например протеин­киназа А, протеинкиназа С, протеинкиназа G, кальмодулинзависимые протеинкиназы и др.

Протеинкиназы А

Протеинкиназы А (цАМФ-стимулируемые) участвуют в аденилатциклазной системе переда­чи сигнала. Протеинкиназа А состоит из 4 субъе­диниц R 2 С 2 - двух регуляторных субъединиц (R 2) и двух каталитических (С 2) (см. рис. 5-41). Ком­плекс R 2 С 2 не обладает ферментативной актив­ностью.

Комплекс R 2 С 2 разными способами прикреп­ляется к мембране. Некоторые формы протеин­киназы А «заякориваются» с помощью али­фатического остатка миристиновой кислоты ка­талитических субъединиц. Во многих тканях про­теинкиназа А связана с «заякоренным» белком АКАР s (от англ. сАМР dependent protein kinase anchoring proteins). АКАР s имеет центр связыва­ния для регуляторных субъединиц протеинкина­зы А. С помощью белка АКАР s протеинкиназа А связывается с мембраной в области локализации ферментов, катализирующих образование цАМФ (аденилатциклаза) или его гидролиз (фосфодиэстераза), а также белков, в регуляции активности которых фермент принимает участие, например потенциалзависимые Са 2+ -каналы.

Регуляторные субъединицы протеинкиназы А имеют специфические центры для связывания цАМФ. Присоединение цАМФ к регуляторным, субъединицам приводит к изменению конформации последних и снижению сродства к каталитическим субъединицам С, происходит диссоциация по схеме:

цАМФ 4 + R 2 С 2 -> цАМФ 4 R 2 + С + С

Субъединицы С представляют собой активную форму протеинкиназы А, которая катализирует реакции фосфорилирования по серину и треонину. Каталитические субъединицы С у разных типов протеинкиназ а не идентичны, они различаются прежде всего специфичностью в отношении белков-субстратов.

Протеинкиназы С

Протеинкиназы С участвуют в инозитолфосфатной системе передачи сигнала. Фермент со­стоит из двух функционально различных до­менов - регуляторного и каталитического. Регуляторный домен содержит 2 структуры («цинковые пальцы»), образованные фрагмента­ми пептидной цепи, богатыми цистеином, и содержащими 2 иона цинка (см. раздел 1). «Цинковые пальцы» участвуют в связывании диацилглицерола. Другой фрагмент регуляторно­го домена имеет высокое сродство к Са 2+ . По­вышение концентрации кальция в цитозоле увеличивает сродство протеинкиназы С к фосфатидилсерину мембраны. Транслокация про­теинкиназы С к мембране позволяет ферменту связаться с ДАГ, который ещё больше повыша­ет сродство протеинкиназы С к ионам кальция (рис. 5-38). Наиболее распространённые изоформы протеинкиназы С активируются Са 2+ , диацилглицеролом и фосфатидилсерином.

5-38. Регуляция активности протеинкиназы С (ПКС). ФС - фосфатидилсерин; ДАГ - диаципглицерол.

Каталитический домен имеет центр, связывающий АТФ и белок-субстрат. Активная фермента протеинкиназы С фосфорилирует по остаткам серина и треонина. Снижение концентрации ионов кальция в клетке нарушает связь протеинкиназы С с фосфатидилсерином и диацилглицеролом, фермент переходит в неактивную форму и отделяется от мембраны.

3. Протеинкиназы G

В отличие от протеинкиназы А, протеинкиназа G присутствует не во всех тканях, ее обнаруживают в лёгких, мозжечке, гладких мышцах и тромбоцитах. Изоформы протеинкиназы G могут быть связаны с мембраной или находиться цитоплазме. Растворимая протеинкиназа С состоит из двух идентичных субъединиц, каждая из которых имеет два центра для связывания цГМФ. Приединение цГМФ к регуляторным центрам вызывает конформационные изменения субъединиц и повышает каталитическую активность фермента (рис. 5-39). Протеинкиназа G, подобно протеинкиназе А и С, специфична в отношении определённых белковых субстратов, которые она фосфорилирует по остаткам серина и треонина.

Рис. 5-39. Регуляция активности протеинкиназы G (ПКG).

Ж фосфодиэстеразы

Фосфодиэстеразы - ферменты, катализирующие превращение цАМФ (рис. 5-40) или цГМФ в неактивные метаболиты АМФ или ГМФ. Фосфодиэстеразы, снижая концентрации вторичных посредников, разрывают цепь превращений, вызванных активатором рецептора.

Рис.5-40. Превращение цАМФ в АМФ.

Фосфодиэстеразы присутствуют в клетках тка­ней в 2 формах: в форме растворимого белка и мембранносвязанного. Формы фермента, связан­ные с мембраной, в разных тканях составляют 5-40%. В одной и той же ткани могут присут­ствовать разные формы фосфодиэстеразы, раз­личающиеся по сродству к субстратам, молеку­лярному весу, заряду, регуляторным свойствам и локализации в клетке.

Фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов не обладают абсолютной специфичностью, по­этому, как правило, одна и та же форма фер­мента способна гидролизовать как цАМФ, так и цГМФ. Однако скорости гидролиза этих двух нуклеотидов под действием одной и той же фосфодиэстеразы могут значительно различать­ся. Это зависит от того, какая фосфодиэстераза присутствует в клетке - более специфичная в отношении цАМФ или более специфичная к цГМФ, от соотношения концентраций цАМФ и цГМФ в клетке и от действия регуляторов фосфодиэстеразы.

В большинстве тканей присутствует фосфоди­эстераза-1, более специфичная к цАМФ, активи­руемая Са 2+ , комплексом 4 Са 2+ -кальмодулин и цГМФ.